Tracking-seq2 扩展 CRISPR 脱靶检测，原代细胞中发现个体差异驱动的特异风险

学术圈重大事件 · 发布 2026-08-12T06:40:00+08:00 · 更新 2026-08-12T06:47:16+08:00

核心结论

Nature Communications 8 月 11 日发布 Tracking-seq2，通过在原 Tracking-seq 中加入外源 5′→3′ 外切核酸酶和非同源末端连接通路抑制，提高 Cas9、Cas12a、胞嘧啶/腺嘌呤碱基编辑器及先导编辑器的脱靶检出灵敏度。方法可直接用于原代 T 细胞和 CD34+ 造血干/祖细胞，并检出非经典 PAM、最多 7 个错配的真实位点。不同供者的基因变异会改变局部同源性和脱靶谱，提示临床基因编辑安全评估可能需要患者级别验证。

Nature Communications 8 月 11 日在线发表华东师范大学、清华大学等团队的 Tracking-seq2 研究。首款 CRISPR 疗法已获批，碱基编辑和先导编辑也进入临床开发，但“在患者真正使用的细胞中是否切到错误位置”仍是安全瓶颈。无细胞检测覆盖广，却缺少染色质环境并可能产生较多假阳性；细胞内方法更贴近治疗条件，但弱信号常被正常 DNA 修复和测序背景掩盖。

Tracking-seq2 在原 Tracking-seq 的损伤标记框架上加入外源 5′→3′ 外切核酸酶，以延伸编辑器造成的切口或单链缺口信号，并用非同源末端连接（NHEJ）通路抑制剂减少标记被快速修复。论文测试 Cas9、Cas12a、胞嘧啶碱基编辑器、腺嘌呤碱基编辑器和先导编辑器，覆盖双链断裂、单链切口和不同修复路径。与 GUIDE-seq-2 等方法比较时，它检出更多候选，并通过杂交捕获和靶向扩增测序验证了一批被其他方法漏掉的真实位点。

值得关注的是，新增位点中包括 NAG、NCG、NTG、NGA、NGC 等非经典 PAM，以及与向导 RNA 相差 6—7 个碱基的罕见事件，说明只按常用序列规则预测可能漏掉低频风险。方法可直接用于原代人 T 细胞和 CD34+ 造血干/祖细胞；起始细胞从 50 万降至 5 万或 10 万时，5 万以上仅轻度减少检出位点，而 1 万细胞的弱信号已难与背景区分，因此作者建议原代细胞至少约 5 万个。

同一向导 RNA 在 HEK293T、T 细胞、造血干/祖细胞及不同 T 细胞供者间出现少数特异位点。靶向测序确认，一部分差异来自供者在潜在脱靶位点上的天然多态性，它提高了局部序列与向导 RNA 的同源度；另一些差异可能还受细胞状态影响。对基因治疗开发者而言，这意味着只在标准细胞系或参考基因组做一次脱靶筛查可能不够。边界是该平台仍需独立实验验证候选，灵敏度不等于能预测临床毒性，且参考版稿件尚待出版社最终排版。

信息来源

• Nature Communications 论文
• DOI

可信度说明

来源为同行评议论文页和出版社参考版 PDF，编辑器类型、原代细胞、低细胞量测试、非经典 PAM、最多 7 个错配及供者差异均有实验与靶向测序支持。论文仍为未最终排版版本；方法学比较受向导、细胞和验证阈值影响，不能把“检出更多”直接解释为已证明更安全。

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